【解读】感染SARS-CoV-2患者的定量检测和病毒含量分析
2020-06-16 18:04
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感染SARS-CoV-2患者的定量检测和
病毒含量分析
Quantitative Detection and Viral Load Analysis of SARS-CoV-2 in Infected Patientsr
期刊：Clinical Infectious Diseases
影响因子：9.055
通讯作者单位：Beijing Ditan Hospital, Capital Medical University, and the Beijing Key Laboratory of Emerging Infectious Diseases
新型冠状病毒SARS-CoV-2被确定为2019冠状病毒病(COVID-19)的病原体。新冠肺炎疫情在全球蔓延，已成为国际关注的突发公共卫生事件。
目前，逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)检测病毒核酸被认为是COVID-19病因诊断的金标准[8,9]。然而，RT-PCR的敏感性和可靠性受到质疑，一些患者的临床表现和暴露史高度怀疑患病为阴性，但在一些确诊病例恢复后，RT-PCR结果为阳性[10,11]。此外，RT-PCR方法在评估疾病进展和预后的病毒载量分析方面存在局限性，不能评估抗病毒药物的疗效。多项研究表明，微滴式数字PCR (ddPCR)具有绝对定量的优势，对病毒检测比RT-PCR更敏感[12,13]。在本研究中，我们比较了RT-PCR和ddPCR在COVID-19诊断中的作用，并探讨了不同组织样本和SARS-CoV-2患者疾病进展过程中病毒载量的变化。
2020年2月5日至2月19日，首都医科大学北京地坛医院对127名患者的400份样本同时进行RT-PCR和ddPCR检测。如图1所示，纳入的127例受试者中，确诊病例54例，疑似病例39例，因发热或呼吸道症状筛查但不符合疑似病例诊断标准的患者34例，具体如下:1例暴露史，2例临床症状(发热和/或呼吸道症状、病毒性肺炎影像学特征、发病早期白细胞计数正常或低、淋巴细胞计数减少)，或无明确暴露史但3例有临床症状。诊断标准为先满足疑似条件，RT-PCR检测阳性或与SARS-CoV-2[9]高度同源的病毒基因测序阳性。在疑似病例中，发现17例非COVID-19, 22例呼吸道样本为SARS-CoV-2阳性确诊病例。因此，本研究共纳入76例确诊患者。
图1
采集鼻拭子、咽喉拭子、痰、血和尿液样本。使用QIAamp QIAamp病毒RNA迷你试剂盒(Qiagen, Hilden, Germany)按照说明书在2小时内提取病毒RNA。随后进行RT-PCR和ddPCR检测。
34例筛查病例和17例疑似病例被排除在进一步分析之外，因为来自这些患者的77份样本经两种方法检测均为阴性。76例COVID-19确诊病例被纳入最终分析。确认参与者的特征。中位年龄40岁(四分位范围[IQR]为32-63岁;范围为6个月至92岁)，男性比例为50%。入院时最常见的症状和体征是发热(88.2%)和咳嗽(69.7%)。两名患者没有任何症状或体征。其中，77.6%为轻度，22.4%为重度。从临床分期来看，康复期49例，占比最大(64.5%)，其次为进展期(10.5%)、早期(9.2%)、临床治愈期(6.6%)。7名患者由于胸部成像正常而处于不确定阶段。从症状出现到发病后早期、进展和恢复期的平均天数分别为4(范围2-6)、12(范围7-19)和20(范围10-33)天。
通过RT-PCR和ddPCR对来自76名确诊患者的323个样本进行了测试，包括痰（116，35.9％），咽拭子（134例 41.5％），鼻拭子（55例 17.0％），尿液样本（14例 4.3％）和血浆样品（4例 1.2％）。根据RT-PCR结果，有95份阳性，67份为单基因阳性，161份为阴性。95个阳性样品的ddPCR结果也呈阳性，RT-PCR的Ct值与ddPCR测定的拷贝数高度相关（ORF1ab，R 2 = 0.83；N，R 2 = 0.87）。但是，当Ct值介于34和38之间时，则没有相关性，或者只有很弱的相关性（ORF1ab，R 2 = 0.08；N，R 2＝ 0.16）。在67个单基因阳性样品中，ddPCR阴性的有26个（38.8％），阳性的有41个（61.2％）为阳性，拷贝数范围为11.1至123.2拷贝/测试（图2B）。通过RT-PCR鉴定的161个阴性样品中，有157个（97.5％）样品通过ddPCR阴性，阳性的4个样品，拷贝数在11.3拷贝/测试和20.7拷贝/测试之间。
图2
A. 不同组织样品的病毒载量。B.COVID-19不同临床阶段的病毒载量分析。C.2名进展期患者的痰液样本中病毒载量的动态变化。D.2名恢复期患者的痰标本中病毒载量的动态变化。E.在9天的检测中2名康复期患者的病毒载量低水平波动。
以上结果表明，痰液样本可能更好地反映了体内病毒复制的水平。因此，我们用来自44位确诊患者的116份痰标本进一步分析了疾病阶段病毒载量的动态变化。结果表明，早期和进展期的病毒含量显着高于恢复阶段的病毒含量（46 800±17 272 vs 1252±1027，P <.001）。由于样本有限，因此动态观察了6名患者。观察到两名处于进展期的患者（患者A和B）3次，病毒含量随时间增加（图3C）；分别观察了2名处于恢复阶段的患者（患者C和D）4次，并且病毒含量随时间下降（图3D）。此外，在2月11日至19日分别观察了其他2例患者（患者E和F），分别观察了6次和7次（图3E）。患者E有4例采用RT-PCR的单基因阳性结果，患者F有5例，并且ddPCR显示病毒载量波动低于150 copys/test。
为了确定不同组织样品中SARS-CoV-2的病毒载量水平，疾病进展过程中的动态变化以及ddPCR检测病毒的性能，共分析了来自76位确诊患者的323个样品。我们发现RT-PCR和ddPCR对高浓度病毒样品给出了一致的结果；但是，ddPCR在检测低浓度病毒样品方面更好。不同组织的病毒含量显示，痰液样本中的病毒比喉咙和鼻拭子要多。痰液样本的定量结果表明，在COVID-19的病程中，病毒含量先升高后降低。
RT-PCR和ddPCR的结果在95个阳性样品中是一致的，并且RT-PCR的Ct值与ddPCR的拷贝数值高度相关。但是，当Ct值介于34和38之间时，具有相同Ct值的样品的病毒载量明显不同，这表明当病毒含量较低时，RT-PCR的Ct值可能无法敏感地反映病毒含量的水平。这一结果与之前的报道是一致的。在67个单基因阳性样品和4个RT-PCR阴性样品中，ddPCR在低浓度病毒的情况下给出了阳性结果，这表明RT-PCR在检测低浓度病毒样品中不稳定。通过动态检测病毒载量，液滴数字PCR可能在评估抗病毒药物的疗效中起重要作用。
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